線虫 シングルgRNA発現ベクター

CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated protein 9)システムは様々な生物種でin vitroおよびin vivo遺伝子機能破壊を行うことできます。このゲノム編集システムでは、Cas9はガイドRNA（gRNA）と複合体を形成し、ゲノム内の相補的な18-22 ntの標的配列と直接相互作用することによって特異的なターゲッティングを実現します。Cas9はgRNAに相補的な配列につづいてプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）NGGを持つゲノム配列を切断します。切断された2本鎖DNAは相同組換え、または非相同末端結合によって修復された結果、様々な長さのインデル（ゲノム中の塩基の挿入または欠失）が生じます。

線虫（C. elegans）にCRISPR/Cas9遺伝子編集を行うためには、All-in-oneベクター（Cas9-gRNA共発現ベクター）または個別のCas9およびgRNA発現ベクターを細胞に導入することで、ノックアウト株を作製できます。シングルｇRNA発現ベクターは線虫U6プロモーターの制御下でｇRNAを発現します。シングルｇRNA発現ベクターはCas9発現ベクターとともに線虫の生殖腺の遠位に注入することによって、生殖細胞の核に導入されます。その後、子孫を選抜することで目的の遺伝子ノックアウトを持つ安定変異系統を得ることができます。

このベクターシステムについての詳細は以下の論文をご参照ください。

弊社のgRNA発現ベクターは、大腸菌での高コピー数と高効率トランスフェクションに最適化されています。gRNA発現ベクターは、Cas9発現ベクターと併用することで線虫における効率的なゲノム編集を実現するよう最適化されています。

簡便さ: ウイルスベクター作製やウイルス製造などは高い技術が必要となりますが、プラスミドのインジェクションは技術的に簡便です。

安定した変異導入: CRISPR/Cas9遺伝子編集を生殖細胞に実行することで、安定した変異株を作製できる。

遺伝子導入の不均一性： 高コピーの遺伝子を導入できるが、導入コピー数にばらつきが出やすい。ある細胞では多くのコピーが導入されるが、他の細胞では少数コピーのみが導入されたり、全く導入されない場合もある。

PAMが必要：CRISPR/Cas9システムはgRNA認識配列の3’末端のすぐ隣にPAMと呼ばれる配列が必要です。

CeU6: 強力な線虫U6 small RNAプロモーター。

gRNA: Cas9の種類に適応するgRNAを使用する。

Terminator: Pol lll転写ターミネーター。Pol lll RNAポリメラーゼによって転写されたsmall RNAの転写を停止する。

Ampicillin:  アンピシリン耐性遺伝子。　E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

pUC ori:   pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。